熒光定量PCR是一種分子生物學技術，用于檢測DNA或RNA樣本中的特定序列。這種技術通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產物量的變化。
一、原理
這是一種以熒光信號為基礎的PCR技術，它是利用熒光染料標記的靶分子在PCR反應過程中的特異性擴增，實現DNA分子定量分析的一種方法。
熒光定量PCR分為兩種方法：染料法和探針法。是一種結合雙鏈DNA的染料，它在PCR反應過程中結合到擴增產物中，產生特異性熒光信號，從而實現實時監(jiān)測PCR反應的熒光定量。探針法是利用特殊的探針標記目標序列，這種探針在熒光棒上加有熒光基團，只有在PCR反應的溫度高于探針的脫離溫度時，才能與目標序列特異性雜交并釋放熒光信號，其子類包括TaqMan探針、分子信標探針和通量探針等。
二、技術方法
1.樣本的制備
需要進行精細樣品制備，樣品制備方式與檢測目的密切相關。例如，如果是檢測基因的表達水平，需要提取RNA進行反轉錄合成cDNA，如果要檢測特定DNA序列，可以用PCR擴增獲取擴增產物，并進行目標序列的純化或酶切等操作。
2.PCR反應體系的制備
PCR反應體系的制備需要注意靈敏度和特異性，并且需要進行良好的優(yōu)化。體系包括模板、引物、酶和緩沖液等。引物是qPCR的關鍵部分，它必須能夠牢固地結合到樣品DNA上，擴增出特定的擴增產物。緩沖液用于維持PCR反應體系的pH和離子強度，酶則是擴增產物的生成催化劑。
3.PCR反應過程
PCR反應過程分為三個階段：變性、退火和延伸。擴增參數如溫度和時間等會影響PCR效率和特異性，溫度和時間要根據反應體系優(yōu)化。
4.數據分析和結果的解釋
結果需要通過熒光曲線得到，并在以標準曲線為基礎的測量下，通過一系列的基因表達分析軟件進行分析。
三、技術應用
1.基因表達分析
可以用于基因表達與調控研究，利用該技術可以實現不同時間點或不同處理條件下目標基因的表達量的定量測量，進而探究基因的功能和調控機理，以及生物發(fā)育、疾病診斷等領域中的應用。
2.微生物檢測
可以在不需要生長或培養(yǎng)微生物的情況下，通過在其核酸序列上進行PCR反應和熒光定量來檢測微生物的存在和含量。這種方法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法更快、更靈敏和更準確。
3.進化研究
可以用于研究特定DNA序列的變異和多態(tài)性，并確定DNA序列的起源和進化方向。該技術廣泛應用于生物系統(tǒng)進化、物種鑒定和親緣關系等領域中。
4.腫瘤診斷
可以用于診斷某些腫瘤的存在和發(fā)展。比如可以在患者血液、組織和體液等樣品中檢測癌細胞的DNA或RNA，在早期檢測和治療方面有重要的臨床價值。
四、注意事項
1.PCR反應體系的優(yōu)化和標準化
PCR反應體系的優(yōu)化和標準化對于結果的準確性和可重復性十分重要。需要根據反應目的和所需的特定樣品的特征對PCR反應體系進行優(yōu)化。
2.選擇合適的引物和熒光探針
引物的設計應該充分考慮基因序列的一些特異性區(qū)域，特別是SNP和Indel的分布，避免出現位點失配。而熒光探針的類型應該根據技術的目的和反應特點進行選擇。
3.樣品的制備和保存
樣品制備和保存的方式應該依據不同實驗目的而定。特別要注意的是，樣品在制備和保存過程中避免受到污染和退化。
4.充分掌握數據分析和結果解讀的技巧和方法
結果不能僅僅從熒光曲線和計數得到，還需要進行基因表達、SNP分析和組織分析等一系列的統(tǒng)計學分析。需要充分掌握數據分析和統(tǒng)計技巧。
總之，qPCR技術已成為生命科學、醫(yī)學和農業(yè)等領域中DNA、RNA檢測和定量的主要手段之一，更加便捷、靈敏、準確。但仍需注意技術細節(jié)和數據分析，避免出現誤差和失誤。隨著該技術不斷的完善和應用，相信它將更加發(fā)揮其重要性。
